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May 16, 2023

Um método de alto rendimento para medição do tamanho do ovo em Drosophila

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 3791 (2023) Citar este artigo 689 Acessos 2 Citações 4 Detalhes das métricas altmétricas Traços da história de vida são usados ​​como proxies de aptidão em insetos, incluindo

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 3791 (2023) Citar este artigo

689 Acessos

2 citações

4 Altmétrico

Detalhes das métricas

Características da história de vida são usadas como substitutos da aptidão em insetos, incluindo Drosophila. O tamanho do ovo é uma característica adaptativa e ecologicamente importante, potencialmente com variação genética entre diferentes populações. No entanto, o baixo rendimento da medição manual do tamanho dos ovos tem dificultado o uso generalizado desta característica na biologia evolutiva e na genética populacional. Estabelecemos um método para medição precisa e de alto rendimento do tamanho do ovo de Drosophila usando citometria de fluxo de partículas grandes (LPFC). As estimativas de tamanho usando LPFC são precisas e altamente correlacionadas com as medições manuais. A medição do tamanho dos ovos é de alto rendimento (média de 214 ovos medidos por minuto) e ovos viáveis ​​de um tamanho específico podem ser classificados rapidamente (média de 70 ovos por minuto). A classificação por LPFC não reduz a sobrevivência dos ovos, tornando-a uma abordagem adequada para a classificação de ovos para análises posteriores. Este protocolo pode ser aplicado a qualquer organismo dentro da faixa de tamanho detectável (10–1500 μm) dos citômetros de fluxo de partículas grandes. Discutimos as aplicações potenciais deste método e fornecemos recomendações para otimizar o protocolo para outros organismos.

O tamanho do ovo é uma característica importante em insetos que evoluíram em resposta a pressões ecológicas e de desenvolvimento1. O tamanho do ovo e outras características da história de vida (por exemplo, sobrevivência, longevidade e fecundidade feminina) são indicadores da aptidão em insetos. Em Drosophila melanogaster, o tamanho do ovo afeta outras características da história de vida, por exemplo, viabilidade embrionária, taxa de eclosão e desenvolvimento embrionário2, e características morfológicas, como o padrão ântero-posterior embrionário3,4. O apinhamento larval5 e fatores ambientais como a temperatura influenciam o tamanho dos ovos de D. melanogaster6,7,8. O tamanho dos ovos de D. melanogaster aumenta com a latitude na Austrália e na América do Sul7, sugerindo que é uma característica adaptativa sob seleção estabilizadora2. Drosophila é um dos organismos multicelulares sexuais mais amplamente utilizados na biologia evolutiva. Essa popularidade se deve em parte ao curto tempo de geração da Drosophila e à facilidade de manutenção em condições de laboratório. Apesar do uso generalizado de Drosophila, o tamanho dos ovos raramente é estudado em estudos evolutivos e de biologia populacional, em parte devido ao baixo rendimento da medição manual do tamanho dos ovos.

Tradicionalmente, o tamanho dos ovos era medido quando visualizados ao microscópio ou estereoscópio2,7,8,9,10. Alternativamente, os ovos são fotografados ao microscópio e seus tamanhos são medidos manualmente a partir das imagens3,4,11,12. Recentemente, algumas ferramentas de análise de imagens foram desenvolvidas para calcular automaticamente o tamanho dos objetos13,14. Os métodos que dependem de medições manuais são demorados e tediosos porque os ovos devem ser transferidos manualmente e organizados na orientação adequada antes da obtenção das imagens. Medir o tamanho do ovo manualmente também está sujeito a erros devido ao preconceito do experimentador. Os pipelines de análise de imagens também exigem que os espécimes sejam fotografados contra um fundo com cor e brilho específicos13. Além disso, medições manuais ou ferramentas de análise de imagem geralmente não podem garantir a recuperação de ovos viáveis ​​que possam ser usados ​​para análises posteriores.

A citometria de fluxo permite a classificação rápida e precisa e a medição do tamanho de pequenos objetos de até 200 µm. Mas o tamanho médio dos ovos no subgrupo de espécies de D. melanogaster varia de 400 a 600 µm4,5,8,9,10, o que é grande demais para ser processado com os citômetros de fluxo tradicionais. O advento da citometria de fluxo de partículas grandes (LPFC) tornou possível a medição de objetos vivos de até 1.500 µm. Os sistemas LPFC operam a uma taxa de fluxo mais lenta e a pressões mais baixas em comparação com os citômetros de fluxo tradicionais para evitar forças de cisalhamento perturbadoras. O LPFC tem sido utilizado para a análise de organismos marcados com fluorescência ou transgênicos, por exemplo, ovos de nematóides15, D. melanogaster16 e Anopheles gambiae17, e larvas de coral18. Objetos rotulados não fluorescentes também podem ser analisados ​​e classificados no LPFC apenas com base no seu tamanho. No entanto, na ausência de rotulagem fluorescente, a forma dos objetos afeta a precisão da estimativa do tamanho. Por exemplo, a forma das sementes de Arabidopsis é esferóide prolato ou cardióide, portanto a medição do tamanho das sementes de Arabidopsis é quase independente da orientação das sementes. No entanto, para objetos com formas elipsóides oblatas ou proladas, como ovos de Drosophila, o tamanho estimado pode variar dependendo da orientação dos objetos no citômetro de fluxo. O tamanho do objeto é medido adequadamente apenas quando os objetos estão orientados ao longo do seu eixo, mas pode ser subestimado se os objetos não passarem ao longo do seu eixo (Fig. 1A, B).